青春双歧杆菌可通过Treg/Th2应答和重塑

肠道菌群，改善DSS诱导的慢性结肠炎

题目：B.adolescentisameliorateschroniccolitisbyregulatingTreg/Th2responseandgutmicrobiotaremodeling.

发表期刊：Gutmicrobes

发表时间：.2.9

通讯研究者：ShujieChen

发表单位：ZhejiangUniversity

DOI：10./..

论文框架：

一、摘要:

炎症性肠病(IBD)是一种预后不良的免疫失调疾病。基于肠道微生物调节的各种治疗方法已被提出。本研究旨在探讨青春双歧杆菌（B.adolescentis）对IBD的治疗作用，以及B.adolescentis在治疗IBD时的免疫和微生态机制。与本研究的队列和GMrepo数据库中的正常人相比，IBD患者的粪便中B.adolescentis水平降低。为了进一步阐明B.adolescentis在IBD中的作用，研究人员用三个周期的葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导慢性结肠炎。研究发现，B.adolescentis灌胃具有保护作用，表现为显著降低腹泻评分、脾脏重量和增加结肠长度。相应的，B.adolescentis处理组的累积组织学分级降低。此外，经B.adolescentis治疗后，紧密连接蛋白和粘蛋白家族表达增强。同时研究发现TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18、IL-22、IL-9等促炎细胞因子减少，IL-10、IL-4、IL-5抗炎细胞因子明显增加。重要的是，B.adolescentis组的结肠固有层由更多的Treg和Th2细胞组成，这抑制了极端的肠道炎症。此外，16srRNA测序显示B.adolescentis组的B/F（拟杆菌门/厚壁菌门）比值明显增加。尤其是B.adolescentis的应用，在属水平上抑制了Akkermansia和Escherichia-Shigella的过度生长。总之，B.adolescentis通过刺激保护性Treg/Th2反应和重塑肠道微生物，改善了DSS诱导的慢性结肠炎。B.adolescentis的常规治疗可能会改善炎症性肠病的治疗效果。

二、前言

炎性肠病(IBD)的定义是一种慢性肠道炎性疾病，伴有便血、腹痛、腹泻或消化不良。发病率呈逐年上升趋势，是全球医疗负担的主要原因。IBD的发病机制中有一些关键途径。证据表明，遗传因素、粘膜屏障功能缺陷、先天性和适应性免疫以及微生物组成改变有助于IBD病的发生和发展。

普遍认为细胞因子及其相关免疫细胞在IBD的发生中起关键作用。例如，细胞因子决定了IBD中Th1、Th2、T调节性T细胞(Tregs)和Th17细胞的分化。Foxp3Tregs通过分泌IL-10在免疫调节中起关键作用。最近的证据表明，肠道微生物可能是调节免疫反应影响IBD进展的重要因素。本研究提示，有害细菌抗原可能激活抗菌免疫系统，从而防御病原，最终诱导免疫高反应性。此外，微生物失调不仅引起上皮粘膜的改变，而且通过调节细胞因子的活性来激活炎症。IBD通常伴有菌群失调。因此，肠道生态系统的组成和功能与IBD的发生密切相关。这项研究表明，减少肠道微生物区系多样性和关键物种的丧失对于维持肠道内环境稳定是必要的。

目前，益生菌在治疗IBD、免疫治疗、癌症和代谢性疾病方面的有效性已经被被用于实验和机制研究，许多研究发现IBD肠道菌群发生了变化，一些研究人员发现，下降的主要是Bifidobacteria（双歧杆菌）和Lactobacillus（乳杆菌）。双歧杆菌属是肠道菌群的主要组成部分，在健康人体内具有多种益生菌功能。有几种双歧杆菌显示出抗炎活性。此外，B.adolescentis可以保护由Y.enterocolitica感染的DSS诱导的急性结肠炎小鼠。此外，B.adolescenti通过改善肠道屏障功能，减轻由HFD引起的肥胖。

B.adolescenti对宿主免疫系统的作用以及慢性结肠炎肠道微生物群的详细变化仍未得到充分研究。在这项研究中，研究人员分析了一些已知的在线数据库中的益生菌，然后发现B.adolescentis是产生显着差异的益生菌之一。因此，本文研究了益生菌B.adescentis如何通过调节Treg和Th2细胞以及肠道菌群组成来改善小鼠慢性结肠炎模型的肠道生态系统。

三、研究结果

3.1B.adescentis丰度与溃疡性结肠炎的临床相关性

首先在GMrepo数据库中分析了在健康人群和IBD患者粪便中的L.lactis,L.casei,L.rhamnosus,L.fermenti等乳杆菌的益生菌水平，以及B.adolescentis,B.bifidum,B.breve,B.longum等双歧杆菌益生菌水平(Figure1a-h)。表中列出了细菌的详细情况，包括确切的样本数量、中位数和数值(Figure1i)。由于我们的研究重点是B.adolescentis在溃疡性结肠炎中的作用，所以我们接下来检测了48例健康人和39例溃疡性结肠炎患者粪便中B.adolescentis的丰度。通过定量聚合酶链反应(qPCR)检测，UC患者的B.adolescentis丰度(-ΔCT)显著低于正常对照组(Figure1g)。这些结果表明，B.adolescentis与溃疡性结肠炎的进展有关。

Fig1B.adolescentis丰度与溃疡性结肠炎的临床相关性

(LinaFanetal;)

3.2灌胃B.adolescentisATCC改善DSS诱导的慢性结肠炎

为了进一步阐明B.adolescentis在IBD中的作用，我们用3%的DSS加B.adolescentis或PBS喂养C57L/B6小鼠36天(图2a)。首先，我们通过检测DSS模型和ABX（抗生素）模型中B.adolescentis组和PBS组小鼠粪便和结肠组织中B.adolescentis的相对丰度，证实了B.adolescentis具有定植C57/B6小鼠的能力(补充图1a-d)。然后我们发现，与灌胃PBS的小鼠相比，灌胃B.adolescentis的小鼠表现出明显的低腹泻评分和体重增加的趋势(图2b和补充图1e)。此外，与PBS组相比，B.adolescentis显示出更长的结肠长度和更少的结肠炎症，这一点通过结肠重量与结肠长度之比得到了证实(图2c)。此外，结肠切片的组织学检查显示，与灌喂PBS的小鼠相比，灌胃B.adolescentis的小鼠具有更低的以炎症损伤、炎症浸润和隐窝损伤为特征的累积评分(图2d，e)。与明显的慢性结肠炎相一致，脾脏重量(图2f)在B.adolescentis组小鼠中明显低于PBS组小鼠。综上所述，这些结果表明，B.adolescentis可以保护小鼠免受慢性结肠炎的侵袭。

Fig2灌胃B.adolescentisATCC改善DSS诱导的慢性结肠炎

(LinaFanetal;)

3.3B.adolescentisATCC的使用诱导肠道屏障增强

为了研究B.adolescentis在DSS诱导的结肠炎中对结肠上皮屏障的影响，我们采用Alcian蓝PAS染色法对粘液层厚度进行了研究。粘液层厚度被认为反映了肠道屏障的功能，保护上皮免受有害因素的影响。我们发现，在DSS处理后，与PBS小鼠相比，B.adolescentis治疗组小鼠的粘液层厚度增加(图3a)。此外，我们发现，与DSS处理小鼠给予PBS相比，接受B.adolescentis治疗的小鼠中occludin的蛋白水平显著升高，同时，claudin在这两组中没有差别(图3b)。一致地，基因occludin的mRNA表达水平呈现出相同的趋势(图3c)。Occludin是一种重要的跨膜和细胞内紧密连接蛋白。粘蛋白是构成肠道屏障的关键成分，所以我们在实验模型中研究了粘蛋白家族muc2、muc3的表达。我们发现，与PBS组相比，B.adolescentis组muc2和muc3mRNA表达水平升高(图3d，e)。这些结果表明，B.adolescentis诱导的肠道屏障增强有助于慢性结肠炎的恢复。

Fig3B.adolescentisATCC的使用诱导肠道屏障增强

(LinaFanetal;)

3.4B.adolescentisATCC诱导抗炎因子的分泌

为了了解B.adolescenti缓解慢性结肠炎的原因，我们对典型的促炎和抗炎细胞因子进行了评估，因为在研究中，组织学分析发现巨噬细胞的浸润和结肠组织的损伤。为了鉴定结肠分泌的细胞因子，用Th1/Th2/Th9/Th17/Th22/Treg细胞因子17-Plex板对B.adolescenti组和PBS组小鼠结肠匀浆上清液进行了细胞因子谱分析。如图4所示，Th17型细胞因子肿瘤坏死因子α（TNF-α，(图4a)、IL-6(图4b)，IL-1β(图4c)B.adolescenti组结肠匀浆上清液中水平明显低于PBS组。Th1型细胞因子IL-18(图4d)、Th22型细胞因子IL-22(图4e)和Th9型细胞因子IL-9(图4f)也下降。同时，结肠匀浆上清液中Treg类细胞因子IL-10(图4G)、Th2型细胞因子IL-4(图4H)和IL-5(图4I)均升高。其他细胞因子如IL-17A和干扰素-γ在这两组中无明显差异(补充图1f)。这些结果提示，B.adolescenti可抑制促炎细胞因子的分泌，诱导抗炎细胞因子的产生，从而减轻慢性结肠炎。

Fig4B.adolescentisATCC诱导抗炎因子的分泌

(LinaFanetal;)

3.5B.adolescentisATCC触发结肠固有层中的保护性Treg和Th2细胞应答

先前的研究表明，Treg通过分泌IL-10抑制结肠炎症。另一方面，Th2细胞主要分泌IL-4，IL-4的释放反过来刺激Th2细胞活化。在之前的数据中，由于DSS模型中B.adolescentis治疗后Treg型细胞因子IL-10，Th2型细胞因子IL-4和IL-5增多，因此随后试图确定通过B.adolescentis调节结肠炎发病机制的CD4+T细胞亚型。我们发现B.adolescentis组总T细胞(CD4/CD3细胞：20.3%vs14%，p0.05)增加(补充图2a)。此外，与灌胃PBS的小鼠相比，B.adolescentis组的小鼠显示出结肠固有层Th2细胞(Th2/CD4T细胞：4.32%vs2.28%，p.)和Treg细胞(Treg/CD4T细胞：45.6%vs34.8%，p0.05)的增加(图5d)。同时，我们发现其他辅助性T细胞Th1和Th17细胞在用DSS处理的B.adolescentis组和PBS组中没有明显的差别(图5a，c)。

先前的研究报道，转录因子Helios的表达已被证明是鉴定稳定的nTregs的有用标志物，而nTregs可以诱导自身免疫性疾病被抑制。为了进一步研究确切的Treg细胞亚群，我们进行了Foxp3和Helios的免疫荧光染色，然后我们发现，与PBS组相比，DSS处理的B.adolescentis组的Foxp3和Helios双阳性细胞减少(图5e)。此外，结肠组织中的Helios蛋白水平也明显下调(图5f)。这些数据表明，Helios阳性的nTreg细胞对Treg细胞总数的增加没有贡献。在体外，我们将分离的脾细胞与B.adolescentis共培养，以验证实验结果。正如预期的那样，流式细胞术显示，B.adolescentis组的nTreg(CD3+CD4+Foxp3+Helios+细胞)减少(补充图2b)。这些结果表明，B.adolescentis部分通过恢复Treg和Th2细胞来预防慢性结肠炎的发展。

Fig5B.adolescentisATCC触发结肠固有层中的保护性Treg和Th2细胞应答

(LinaFanetal;)

3.6DSS降低微生物多样性，重塑微生物群落

大量研究表明，肠道菌群在IBD的缓解或发展中起着至关重要的作用。在研究B.adolescentis微生物结肠炎的影响之前，我们首先确定了葡聚糖硫酸钠诱导的慢性结肠炎的微生物紊乱和特征。为探讨DSS治疗对肠道微生物区系组成的影响，我们在DSS模型开始时收集小鼠粪便作为基线，并在给药后第35天收集粪便。取小鼠粪便进行16SrRNA测序。我们发现，在给药后第35天，粪便细菌的共生丰富度和多样性比给药前的第0个时间点显著降低，这在ace、chao和sobs指数中表现得尤为明显(Figure6a-c)。此外，我们通过OUT水平上的主坐标分析(PCoA)图检查了改变的微生物结构，该图清楚地显示了样本组的距离(β多样性)。此外，我们发现PCoA图被分成两个凝聚组，分别对应于第0天和第35天这两个时间点(图6d)。

为了进一步表征分类组成中的表型变化，我们进行了LEfSe分析，以确定在第0天和第35天之间具有生物一致性的差异丰富的生物标志物(图6E)。我们发现在两组之间，在多个系统发育水平上都观察到了一些丰富的分类单元。然后，我们用Wilcoxon秩和检验比较了门和科水平上的相对类群丰度。与基线第0天相比，第35天的菌门发生了重大变化，包括Actinobacteria和Tenericutes减少(P0.01)，Verru
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